El informe de revisión de la EMA para las vacunas COVID-19 de Pfizer/BioNTech mencionó que la fabricación de sustancia activa para la vacuna BNT162b2 consta de cinco pasos clave. Entre ellos, las moléculas de ARN son sintetizadas a partir de ADN lineal por unIn vitroTranscripción (IVT)
Seguido de purificación Multipaso y filtración.
El informe recomendó que el Patrocinador implemente estrategias de prueba para garantizar un control microbiano adecuado del material de partida y que el tampón HEPES en la formulación de tampón esté libre de RNasa.
En cuanto a las especificaciones de los excipientes, el informe indica que el tampón de etanol y ácido cítrico de ayuda al procesamiento debe controlarse de acuerdo con la Farmacopea Europea (Ph.Eur.), con las especificaciones de tampón HEPES y EDTA establecidas en comparación con las de la sustancia activa.
De lo anterior, Pfizer/BioNTech utilizó tampón HEPES en la fabricación de vacunas de COVID-19 de ARNm. El informe de revisión también enfatizó la necesidad de que el búfer HEPES esté libre de RNasa.
Basado en el artículo sobre la formulación de ARNm LPX-publicado por BioNTech en 2016, se utilizó tampón HEPES en la solución madre de ARNm de la empresa. Se podría inferir que BioNTech utilizó HEPES como sistema tampón para la solución madre de ARN durante la fabricación de sus vacunas de COVID-19 de ARNm.
HEPES se usó como tampón en la solución madre de ARNm, que puede estar estrechamente relacionada con la IVT DE LA ARN polimerasa.
El uso del par tampón HEPES para la reacción IVT se informó en un estudio ya en 1987. En el estudio, se investigó la ARN polimerasa del virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV) para detectar IVT en diferentes condiciones de reacción. Los resultados mostraron que el tampón HEPES podría maximizar la eficiencia de IVT en comparación con el tampón Tris.
El estudio mostró que, en comparación conTampón TRIS de trometamina, La síntesis de ARN fue tres veces mayor cuando se usó HEPES como tampón (Figura 1a), y la concentración óptima de tampón HEPES fue 400 mM.
Robin Shattock, director del Departamento de Enfermedades Infecciosas del Imperial College of Science, Technology and Medicine, es un experto autorizado en el campo de las vacunas de ARNm y trabaja en estrecha cooperación con BioNTech, PNI y otras empresas biofarmacéuticas líderes. Su equipo publicó un artículo sobre la optimización de la IVT de saRNA en 2021 y afirmó que el uso de HEPES 40 mM como tampón para la reacción de IVT contribuye a una mayor eficiencia de IVT. La conclusión se hizo mediante el cribado y la investigación de los factores primarios que afectan la IVT del saRNA.
Según el artículo sobre la formulación de ARNm de LPX-publicado por BioNTech en 2016, el tampón utilizado en la solución madre de ARNm de la compañía fue HEPES. En el estudio, el RNA-LPX se preparó preparando 1 mg/ml de solución madre de ARN usando tampón HEPES.
Según la literatura relevante, HEPES tiene ventajas como tampón para la reacción IVT, que creemos que es la razón por la que BioNTech utiliza pares de tampón HEPES como sistema tampón para su solución madre de ARNm.
1. El pKa de HEPES varía muy poco con la temperatura, y el pH cambia poco con la temperatura.
2. Las propiedades son estables. HEPES, por un lado, no se compleja con otros iones y afecta a otras funciones iónicas; por otro lado, la presencia de otros iones no afecta la capacidad de amortiguación de HEPES.
3. El pH en el medio de cultivo celular se mantiene principalmente por bicarbonato y 5% CO2En el medio. Cuando las celdas están en un entorno abierto, CO2Escape puede conducir a un rápido aumento del pH fuera del rango fisiológico, pero no es un ISSUE para los medios complementados con pares de búfer HEPES.
4. HEPES no puede cruzar fácilmente las biopelículas y no interfiere con las reacciones bioquímicas dentro de las células.
1. Debido a la presencia del resto de piperazina, H2O2Se produce cuando HEPES se expone a la luz, que es tóxica para las células cultivadas u otras sustancias biológicamente activas. HEPES no debe usarse en combinación con sustancias sensibles a redox. HEPES como tampón debe usarse fuera de la luz solar directa.
2. HEPES se usa comúnmente a concentraciones de 10-25 mM en productos bioquímicos. Tiene una capacidad de tamponamiento débil cuando la concentración es inferior a 10 mM, y puede tener un efecto tóxico en algunas células cuando la concentración es mayor.
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Referencias:
1. GAEL KURATH * t, LEONG J C. Transcripción in vitro del virus de la necrosis hematopoyética infecciosa, un rabdovirus de los peces [J]. The Journal of General Virology, 1987(68): 1767-1771.
2. Samnuan K, Blakney AK, McKay PF, Shattock RJ. Optimización del rendimiento de la transcripción in vitro del Diseño de Experimentos del ARN autoamplificador. bioRxiv; 2021.
3. Informe DE EVALUACIÓN DE LA EMA, nombre común: Vacuna COVID-19 de ARNm (nucleósido modificado).
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