Investigación sobre la aplicación de la trehalosa en la criopreservación celular: OPC criopreservación

D ()-trehalosa dihidrato es un disacárido no reductor estable. Puede formar una película protectora en la superficie de las células bajo diversas tensiones ambientales, como el calor extremo, el frío, la sequía, para proteger eficazmente la estructura de las macromoléculas biológicas del daño. Tiene una excelente función protectora no específica para las células biológicas, y puede mejorar la resistencia de las células biológicas a las condiciones duras.

En los últimos años, la D ()-trehalosa dihidrato se ha utilizado ampliamente en productos biológicos, incluidos fármacos de anticuerpos. Se utiliza como agente protector para aproximadamente 30% de medicamentos con anticuerpos en el mercado (incluidos los ADC), como Adcetris, Padcev, Imjudo, Kimmtrak, etc.

D ()-trehalosa dihidrato también juega un papel cada vez más importante en la criopreservación celular, la reproducción asistida y otros campos. Aquí, el equipo de productos de AVT interpreta la siguiente literatura relacionada para ayudarlo a comprender el progreso de la investigación relevante.

Dihidrato de D(+)-trehalosa para la criopreservación de OPC

1. Trasplante de células precursoras de oligodendrocitos (OPC) para enfermedades desmielinizantes

Las enfermedades desmielinizantes son trastornos neurológicos caracterizados por la pérdida de la vaina de mielina, como lesión de la médula espinal (LME), esclerosis múltiple (EM), etc.

Los OPC pueden diferenciarse en oligodendrocitos madurosIn vivo, Que son células mielinizantes importantes del sistema nervioso central y encapsulan los axones neuronales para constituir estructuras de mielina. Por lo tanto, el trasplante de OPC se considera una terapia altamente potencial para enfermedades desmielinizantes.

2. Métodos y problemas existentes para la criopreservación de OPC

La criopreservación de OPC es un paso crítico en el trasplante exitoso de OPC humanos.

Antes de usarse clínicamente, los OPC humanos se criopreservaron con el crioprotector de 100 ml/L DMSO + 900 ml/L FBS (el método propuesto en 1984), con una tasa de recuperación de 55% a 70%. El método no se optimizó durante mucho tiempo a partir de entonces.

Dado que el DMSO es citotóxico y el FBS es inmunogénico, el método de criopreservación anterior no es adecuado para uso clínico.

Para explorar un método de criopreservación OPC humano más económico, eficaz y seguro que se puede aplicar a gran escala, liu Chang DE LA Universidad Médica del Sur y otros investigadores optimizaron el método anterior utilizando OPC inducidos por células madre neurales del cerebro fetal humano (hNSC).

3. Optimización de métodos para la criopreservación de OPC

① Comparando los efectos de diferentes métodos sobre la tasa de recuperación de OPC, se encontró que la tasa de supervivencia de las células recogidas por digestión era significativamente más alta que la del pipeteo mecánico.

1

Tabla 1: Viabilidad celular y tasas de recuperación antes y después de la criopreservación utilizando métodos de digestión y disrupción mecánica

Group Mechanical digestion

El crioprotector B de A, B

La viabilidad antes de la criopreservación después de la recuperación, la viabilidad de la criopreservación y la viabilidad de la N ° en

② Comparando la tasa de recuperación de OPC criopreservados con cuatro medios de criopreservación diferentes mediante enfriamiento lento en la caja de congelación y enfriamiento rápido en el tanque de nitrógeno líquido en fase de vapor.

Como se muestra a continuación, hubo una diferencia estadísticamente significativa en las tasas de recuperación para las dos velocidades de enfriamiento. Las tasas de recuperación de los cuatro crioprotectores fueron todas menos que 30% por un enfriamiento rápido. La tasa de recuperación del medio de criopreservación E complementado con D ()-trehalosa dihidrato fue la más alta por enfriamiento lento en la caja de congelación, que fue de (75,73 ± 6,66) %.

③ Comparación del efecto de la duración de la criopreservación en la tasa de recuperación de OPC

Las células crioconservadas en el medio de criopreservación E con la tasa de recuperación más alta se seleccionaron para experimentos posteriores, y la tasa de recuperación se comparó entre el corto plazo (<2 meses) criopreservación y criopreservación a largo plazo (6 meses), que no muestran diferencias significativas en la tasa de recuperación entre los dos grupos.

④ Comparando la actividad de proliferación celular

Se seleccionó el medio de criopreservación E con la mayor tasa de recuperación para la comparación de la proliferación celular. El múltiplo de proliferación medio se comparó entre el grupo E del medio de criopreservación y el grupo de control de cultivo normal después de 3 veces de paso en serie al mismo tiempo, y no hubo diferencia significativa entre los dos grupos. Después de 7 días de cultivo, no hubo diferencias significativas en la tasa de proliferación entre el grupo de cultivo normal y el grupo de cultivo posterior al deshielo. Los resultados indicaron que la actividad de proliferación celular de OPC se criopreservó con el medio de crioconservación que contenía D ()-trehalosa dihidrato, que era comparable a la de las células no congeladas.

Conclusión

El estudio concluyó que las OPC inducidas por hNSC recogidas por digestión y cultivadas adherentemente pueden crioconservarse con el medio completo OPS que contiene 70 mL/L DMSO 300 mL/L FBS 0,2 mol/mL D(+)-trehalosa dihidrato durante mucho tiempo por enfriamiento lento y recalentamiento rápido en la caja de congelación, con una tasa de recuperación promedio de hasta 75%. La recuperación después de la criopreservación no afectó la expresión de marcadores específicos de OPC y la capacidad de proliferación.

D ()-dihidrato de trehalosa es un crioprotector no tóxico impermeable a la membrana celular de muchas fuentes, que se ha demostrado que tiene un buen efecto de criopreservación para varios tipos de células como hPBSC y hESC. En este estudio, el medio de criopreservación complementado con baja concentración de D ()-trehalosa dihidrato logró la tasa de recuperación más alta en todos los grupos experimentales. Y los resultados de la proliferación y la expresión del marcador después del cultivo indicaron que el medio de criopreservación añadido con D(+)-trehalosa dihidrato también era adecuado para la criopreservación de OPC humanos y podría mejorar la tasa de recuperación de las células.