En los dos números anteriores, compartimos estudios relevantes sobre el uso de dihidrato de D ()-trehalosa para la criopreservación de células precursoras de oligodendrocitos derivados de humanos (OPC) y células madre derivadas de adiposo (ADSC). Esos estudios encontraron que agregar una cierta cantidad de D ()-trehalosa dihidrato al medio de criopreservación o usar el crioprotector compuesto de D ()-trehalosa dihidrato + glicerol podría mejorar la tasa de recuperación de las células madre después de la criopreservación a largo plazo, contribuyendo así a la posterior aplicación clínica de células madre para el tratamiento de enfermedades o la reparación de heridas.
En este número, tomamos como ejemplo la criopreservación de células germinales de ratón para explorar las perspectivas de aplicación de testiculares D ()-trehalosa dihidrato en el campo de la reproducción asistida.
Efectos de diferentes crioprotectores sobre la criopreservación de células germinales testiculares en ratones inmaduros
En los últimos años, con el rápido desarrollo de la tecnología de reproducción asistida, se ha hecho posible que más y más hombres infértiles den a luz a la descendencia. En el proceso, la criopreservación a largo plazo de las células asociadas a la reproducción se ha convertido en una de las dificultades técnicas clave que afectan la tasa de éxito.
Por ejemplo, para pacientes masculinos prepuberales con cáncer, el tratamiento con toxicidad gonadal puede conducir a una pérdida permanente de fertilidad, Y la criopreservación a largo plazo de tejido testicular o células a bajas temperaturas es un medio importante para preservar su fertilidad.
Sin embargo, para los pacientes con tumores sistémicos, el trasplante autólogo de tejido testicular criopreservado después de la descongelación presenta un riesgo de reintroducción de células cancerosas. Teniendo en cuenta que las células cancerosas se pueden aislar de la suspensión de células testiculares y las células madre espermatogoniales (SSC) se pueden cultivar in vitro para inducir la diferenciación en espermátidas redondas, dar a luz a la descendencia se puede lograr mediante una inyección redonda de espermátidos.
Por lo tanto, para los pacientes masculinos prepuberales con cáncer, la criopreservación a largo plazo de las células germinales testiculares es una de las formas clave de preservar la fertilidad masculina y tiene un valor potencial de aplicación clínica.
Zhang Xiaolong del Hospital Popular Provincial de Henan y otros investigadores utilizaron ratones de dos semanas para simular el estado de desarrollo del tejido testicular inmaduro humano antes de la pubertad. y adoptó diferentes protocolos de criopreservación para criopreservar las células germinales testiculares del ratón para explorar el mejor método de criopreservación.
En el estudio, los medios de criopreservación se dividieron en los siguientes 5 grupos según los diferentes componentes:
Grupo | Composición media de criopreservación |
Un | Medio DMEM/F12 que contiene 10% DMSO + 10% FBS |
B | Medio DMEM/F12 que contiene 10% DMSO + 10% FBS + 0,1 mol/L de sacarosa |
C | Medio DMEM/F12 que contiene 10% DMSO + 10% FBS + 0,1 mol/L D(+)-de trehalosa dihidrato |
D | Medio DMEM/F12 que contiene 15% DMSO + 10% FBS 0,1 mol/L sacarosa + 0,1 mol/L D(+)-de trehalosa dihidrato |
E | Medio DMEM/F12 que contiene 10% DMSO + 10% FBS 0,1 mol/L sacarosa + 0,1 mol/L D(+)-de trehalosa dihidrato |
Control | Células germinales testiculares disociadas del tejido testicular fresco de ratón (sin medio de criopreservación) |
La suspensión de células germinales testiculares de ratón se preparó mediante hidrólisis enzimática en dos etapas, se dispensó y se transfirió a viales criogénicos después de añadir cada uno de los cinco crioprotectores diferentes, respectivamente. Los viales criogénicos se sometieron a congelación programada, se sacaron del tanque de nitrógeno líquido después de 2 meses y se recuperaron para detectar la tasa de supervivencia celular, la tasa de apoptosis y el potencial de membrana mitocondrial.
① Tasa de supervivencia celular y tasa de recuperación antes y después de la criopreservación
En comparación con la de antes de la criopreservación, la tasa de supervivencia celular después de la criopreservación disminuyó en los cinco grupos de prueba. Entre ellos, la tasa de supervivencia celular y la tasa de recuperación en el grupo E fueron significativamente más altas que las de los otros cuatro grupos de prueba.
② Recuperación celular después de la criopreservación
En cada grupo, la tasa de recuperación de las células germinales testiculares después de la criopreservación se evaluó cuantitativamente basándose en el número de células viables realmente recuperadas de 4 mg de tejido testicular disociado y criopreservado después de la descongelación. Los resultados mostraron que el número de células recuperadas en el grupo E fue significativamente mayor que el de los otros cuatro grupos de prueba.
③ Tasa de apoptosis
La velocidad de apoptosis se detectó por citometría de flujo (FC) en cada grupo. Los resultados mostraron que la tasa de apoptosis aumentó significativamente en cada grupo de prueba en comparación con el grupo de control. En los cinco grupos de prueba, la tasa de apoptosis en el grupo E fue significativamente menor que la de los otros cuatro grupos de prueba.
④ Potencial de membrana mitocondrial
En comparación con el grupo de control, el potencial de membrana mitocondrial de las células criopreservadas disminuyó significativamente después de la descongelación en los cinco grupos de prueba, con la menor disminución en el grupo E. Que fue significativamente más bajo que en los otros cuatro grupos de prueba.
Los crioprotectores pueden clasificarse como permeables e impermeables. Los crioprotectores impermeables más utilizados son la sacarosa y el dihidrato de D ()-trehalosa. Un estudio anterior ha confirmado que la adición de sacarosa o dihidrato de D ()-trehalosa a los crioprotectores podría aumentar significativamente la tasa de recuperación de las células germinales testiculares en monos rhesus o ratones.
Los resultados del estudio anterior mostraron que la adición de 0,1 mol/l de sacarosa o 0,1 mol/L D(+)-trehalosa dihidrato de Al crioprotector tenía un cierto efecto protector sobre la criopreservación celular, mientras que la adición de 0,1 mol/L de sacarosa y 0,1 mol/L D(+)-trehalosa dihidrato al mismo tiempo aumentó significativamente la tasa de recuperación de las células germinales testiculares de ratón criopreservadas después de la descongelación, Disminuyó la tasa de apoptosis y redujo el daño al potencial de la membrana mitocondrial causado por la criopreservación.
Sin embargo, la citotoxicidad causada por la mayor concentración de DMSO (15%) compensó parcialmente el efecto crioprotector de la sacarosa y el dihidrato de D ()-trehalosa.
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