Las perspectivas de la congelación de alginato en la criopreservación celular: Congelación de células madre pluripotentes humanas con alginato

En los primeros tres números, compartimos los estudios de D ()-trehalosa dihidrato EN LA crioprotección de células precursoras de oligodendrocitos humanos (OPC), células madre derivadas de adiposo (ADSC), células germinales testiculares del ratón, etc. Estos estudios encontraron que agregar una cantidad adecuada de D ()-trehalosa dihidrato al medio de criopreservación o usar un crioprotector (CPA) Que contiene D ()-trehalosa dihidrato y glicerol puede mejorar la tasa de recuperación de las células después de la criopreservación a largo plazo.

En este número, desarrollamos una comprensión clara del efecto crioprotector del dihidrato de D ()-trehalosa en tres líneas diferentes de células madre pluripotentes humanas a través de un artículo publicado en elInvestigación de células madreEn 2018 por investigadores de Milán, Italia.

Criopreservación de células madre pluripotentes humanas con dihidrato de D(+)-trehalosa

Introducción

Los productos de terapia celular, incluidas las células madre, tienen un alto potencial clínico. El mercado mundial de células madre implica el almacenamiento y la preparación de células madre corriente arriba y media, así como aplicaciones clínicas posteriores. Según el informe de Transparencia Market Research (TMR), se espera que el mercado mundial de células madre alcance los US $270,5 mil millones para fines de 2025. Y la tasa de crecimiento anual compuesta del mercado está en camino de alcanzar el 13.8% en los últimos 8 años.

Para garantizar la aplicación exitosa de productos de terapia celular, la criopreservación a largo plazo de las células es una dificultad técnica que debe conquistarse porque la criopreservación es el único método disponible para la preservación a largo plazo de la viabilidad y la función bioquímica de las células.

Para evitar daños en las estructuras celulares causados por la congelación intracelular, se desarrollan y comercializan los crioprotectores. Los crioprotectores celulares más comúnmente utilizados son el dimetilsulfóxido (DMSO) en combinación con el suero fetal bovino (FBS) o cualquier sustituto del suero.

Sin Embargo, FBS contiene proteínas xenogénicas derivadas de animales que pueden causar infecciones zoonóticas con patógenos desconocidos. Además, El DMSO es citotóxico. Se informa que la toxicidad del DMSO en los tejidos y las células está directamente relacionada con el tiempo de exposición, la temperatura y la concentración. El grado de toxicidad varía según el tipo de célula y se han informado efectos adversos en pacientes reinyectados con células descongeladas sin eliminar DMSO. Además, se sabe que el DMSO afecta el epigenoma de los embrioides de ratón al regular los niveles de transcripción de tres metiltransferasas de ADN (Dnmts) y alterar los perfiles de metilación de todo el genoma. que a su vez conduce a la diferenciación incontrolada de las células madre del ratón. Por todas estas razones, DMSO + FBS no es adecuado para uso clínico. Existe una necesidad urgente de desarrollar crioprotectores eficientes y no tóxicos.

D ()-trehalosa dihidrato es un disacárido no reductor que se encuentra en una variedad de organismos capaces de sobrevivir a la deshidratación completa, como bacterias, levaduras, tardígrados y nematodos. Los mamíferos no producen D ()-trehalosa dihidrato, pero es un crioprotector eficaz de las células de mamíferos, que puede reducir el daño celular causado por la formación de cristales de hielo. El efecto protector de D(+)-trehalosa dihidrato está relacionado con el efecto osmótico y la interacción específica de los fosfolípidos de la membrana celular y las proteínas lábiles, que puede prevenir el daño celular y la desnaturalización debido a la desecación y el estrés oxidativo.

El dihidrato de D(+)-trehalosa no citotóxico se ha utilizado eficazmente para la criopreservación de diferentes tipos de células, como espermatocitos de ratón, células madre hematopoyéticas adultas, células madre mesenquimales, células madre derivadas de la adiposa (ADSC), células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC). D ()-trehalosa dihidrato también se utiliza para la criopreservación de la sangre del cordón umbilical, la médula ósea y los islotes humanos.

El principal obstáculo que impide el uso generalizado de D ()-trehalosa dihidrato celular es que es difícil que en la preservación D ()-trehalosa dihidrato acceda al interior de la célula. Se han aplicado previamente varios medios para abordar el problema, como el choque osmótico, la administración de liposomas, la perforación por calor, la electroporación, la microinyección y la ingeniería genética. Sin embargo, los métodos anteriores requieren operaciones complejas, son laboriosos y requieren mucho tiempo, y pueden conducir a un daño celular significativo.

En este estudio, se criopreservaron tres tipos diferentes de líneas de células madre pluripotentes con cuatro crioprotectores diferentes preparados usando D ()-trehalosa dihidrato solo o en combinación con etilenglicol o glicerol, respectivamente. Luego, las líneas celulares se descongelaron para investigar los parámetros clave, incluida la morfología celular, la viabilidad posterior al deshielo, los niveles de expresión de los marcadores de pluripotencia, la estabilidad genómica, la homeostasis del retículo endoplásmico (ER) y la respuesta al daño del ADN. Medición de la tapa crioprotectoraAcidad de los cuatro crioprotectores en células madre pluripotentes.

Diferentes composiciones crioprotectoras

Todos los crioprotectores se prepararon recientemente y se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células utilizadas en el estudio se criopreservaron usando CS10. CS10 que contiene 10% DMSO es un crioprotector libre de componentes séricos y animales, que se recomienda para la crioprotección de células madre pluripotentes humanas (hPSC).

Criopreservación y descongelación de las células

Cultivar las células bajo condiciones específicas. Disociar hESCs-RC17 con EDTA 0,5 mM, tratar el hiPSCs-CTR2 #6 y ltNES-AF22 con soluciones de desprendimiento de células y almacenar en crioprotectores recién preparados (A, B, C y D). Resuspender 2,0 × 10 ^ 6 células en 1,5 ml de cada crioprotector y transferirse a viales criogénicos.

Enfriar los viales criogénicos en un recipiente de congelación a aproximadamente-1 ℃/min y transferir a un congelador a-80 ℃ después del almacenamiento durante la noche. Después de 24 h, transfiera viales criogénicos a nitrógeno líquido para su almacenamiento durante al menos una semana.

Caliente los viales criogénicos en un baño de agua a 37 ℃ hasta que desaparezca la masa de hielo y diluya la suspensión celular con un medio cálido. Recoger las células de 200g de tejido por centrifugación durante 3 min y sembrar en recipientes de cultivo recubiertos apropiados para cada tipo de célula con el tamaño de inóculo indicado.

Resultados y discusión

① Viabilidad celular

Medir la viabilidad celular con el agente alamarBlue 48 h después de la descongelación.

En primer lugar, para determinar la cantidad apropiada de D(+)-trehalosa dihidrato, etilenglicol y glicerol, se utilizaron diferentes concentraciones de soluciones de un solo componente para diferentes líneas de células madre. Se midió la viabilidad de las células después de la descongelación y se comparó con grupos de control. Los resultados mostraron que 0,5 dihidrato de M D(+)-trehalosa, 10% etilenglicol y 10% glicerol eran cantidades apropiadas, pero había grandes diferencias entre los diferentes tipos de células madre.

Después de determinar la concentración inicial, se utilizaron cuatro crioprotectores diferentes (ver arriba) para la criopreservación de células madre de tres líneas: (Grupo A) hESCs-RC17, (Grupo B) hiPSCs-CTR2 #6, Y (Grupo C) ltNES-AF22. La viabilidad de las células se midió después de la descongelación. La tasa de supervivencia celular también se comparó con las mismas células crioconservadas en CS10 en las mismas condiciones.

Cuando las células se criopreservaron solo con D ()-trehalosa dihidrato (Grupo A), la tasa de recuperación de las células después de la descongelación disminuyó, variando de 20% a 60% para diferentes tipos de células.

Cuando el medio a base de D(+)-trehalosa dihidrato se complementó con etilenglicol 10% o glicerol 10% (Grupos C y D), las tasas de supervivencia celular de hESCs-RC17 y ltNES-AF22 alcanzaron niveles similares a los criopreservados en DMSO. Sin embargo, la tasa de supervivencia celular de la hiPSCs-CTR2 #6 criopreservada en glicerol fue mejor que la del etilenglicol.

Además, comparando los resultados con crioprotectores de control que contenían etilenglicol o glicerol solo, se confirmó que el aumento de la tasa de supervivencia se debía al efecto combinado de Etilenglicol/+ D glicerol (+)-Dihidrato de trehalosa.

Estos resultados sugieren que la D ()-trehalosa dihidrato se puede utilizar para la criopreservación de células madre pluripotentes humanas y se espera que reemplace al DMSO. Y la adición 10% etilenglicol o glicerol 10% puede mejorar significativamente la tasa de supervivencia de los crioprotectores de trehalosa. La tasa media de supervivencia celular se incrementó en comparación con CS10. Los crioprotectores de Etilenglicol/glicerol y D ()-trehalosa dihidrato no contienen proteínas séricas y evitan el riesgo previamente informado de estimular la diferenciación prematura de células madre pluripotentes.

② Morfología celular

Otra preocupación conLa criopreservación de células madre es alteraciones cromosómicas y pluripotencia. Durante la congelación y descongelación, se pueden formar cristales de hielo y burbujas dentro y fuera de las células, alterando los microtúbulos del huso para inducir una segregación cromosómica anormal y dando como resultado cambios en las características y morfología del crecimiento celular. Por lo tanto, la posibilidad de daño al cromosoma y al potencial pluripotente de las células madre se puede evaluar fácilmente observando la morfología de las células después de la descongelación.

La figura superior muestra la morfología celular de hESCs-RC17, hiPSCs-CTR2 #6 y ltNES-AF22 48 h después de la descongelación. Las imágenes de contraste de fase mostraron que los crioprotectores de dihidrato de D( )-trehalosa compuestos no causaron cambios morfológicos significativos en ninguna de las líneas celulares, y la morfología celular fue idéntica a la de las células conservadas en CS10.

③ Nivel de expresión del marcador

Para confirmar que hESCs-RC17, hiPSCs-CTR2 #6, y ltNES-AF22 después de la descongelación conservaron las propiedades y características clave de las células madre pluripotentes, los niveles de expresión de varios marcadores se analizaron por RT-PCR cuantitativos 48 h después de la descongelación.

Los marcadores celulares Nanog, Oct4 y Sox2 se detectaron para hESCs-RC17 y hiPSCs-CTR2 #6, y se compararon con los grupos de control.

Nestina y Sox2 se detectaron durante ltNES-AF22 y se compararon con grupos de control. Los resultados mostraron que el potencial de diferenciación de células madre no se vio afectado.

④ Estabilidad del cromosoma

Para evaluar el efecto de los crioprotectores basados en dihidrato de D( )-trehalosa sobre la estabilidad cromosómica en las células madre, se realizaron cariotipado convencional y aCGH en las tres líneas de células madre. La siguiente figura muestra los resultados de ltNES-AF22 antes y después de la criopreservación.

En general, los cariotipos permanecieron estables, pero se detectaron variaciones en el número de copias (CNV) (cromosomas 2, 8, 19 y 22). Algunos DE LOS CNV pueden haber estado presentes en las células primarias y otros pueden haber surgido al azar durante la manipulación in vitro de las células en lugar de la criopreservación. Ya que no se observaron aneuploidías clonales o aberraciones cromosómicas estructurales antes (Figura C) y después (Figura D) de la criopreservación.

⑤ Evaluación del nivel de proteína de estrés/despliegue ER

El estudio también se centró en si la criopreservación en CS10 o D( )-trehalosa dihidrato afectó la capacidad de las células pluripotentes para responder al estrés del retículo endoplásmico (ER) y activar la respuesta proteica desplegada (UPR). Para mantener la homeostasis en diferentes condiciones fisiológicas o patológicas, ER integra varias señales moleculares y celulares. Tanto el estrés ER como La UPR median mecanismos moleculares y bioquímicos que afectan la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis.

En general, el dihidrato de D( )-trehalosa mostró un nivel moderado de estrés ER/UPR en comparación con CS10. La única línea celular más sensible fue la hiPSCs-CTR2 #6, que mostró niveles más altos de expresión de genes BIP y CHOP en los Grupos B y C, lo que indica que la criopreservación con D( )-trehalosa dihidrato no alteró significativamente la homeostasis ER de células madre multipotentes en comparación con CS10.

Conclusión

La criopreservación a largo plazo de células madre tiene un gran potencial de aplicación en muchos campos, como el trasplante celular y la terapia celular. Varios estudios han optimizado los medios para la criopreservación de células madre pluripotentes humanas, y la criopreservación a largo plazo con D( )-trehalosa dihidrato puede ser un método ideal.

Las células madre pluripotentes humanas conservadas en crioprotectores de dihidrato de D( )-trehalosa mantienen fenotipos celulares y propiedades funcionales, lo que indica aplicaciones potenciales de dihidrato de D( )-trehalosa en la terapia clínica. Aunque se necesitan más estudios para evaluar la bioseguridad de las células criopreservadas con crioprotectores compuestos de D( )-trehalosa dihidrato, la combinación de D( )-trehalosa dihidrato con etilenglicol o glicerol, como un crioprotector de bioseguridad sin citotoxicidad o proteínas derivadas de animales, muestra una gran promesa para aplicaciones clínicas.